干酪乳杆菌发酵及热加工方式对于小麦卵白抗原性的影响（一）

2024-05-05 23:25:14 [焦点] 来源：肉眼凡胎网

小麦过敏、干酪工方乳糜泻、乳杆热加非乳糜泻小麦敏感(NCGS)等“小麦相关疾病”谢世界各地的菌发酵及发病率在不断回升。对于这些疾病患者而言。式对防止摄入小麦致敏卵白是于小原性仅有且实用的措施圈。除了探究过敏机制、麦卵追寻治疗的白抗突破点外，研发低致敏性的干酪工方小麦食物成为之后亟待处置的下场。乳酸菌在发酵历程中经由自己的乳杆热加卵白质水解零星降解相关卵白质及多肽，并经由产酸修正发酵面团的菌发酵及pH值以激活面粉的内源性卵白酶.进一步增强卵白质的降解。在卵白质降解为多肽及氨基酸时，式对既修正了面团风韵，于小原性也修正了致敏卵白的麦卵含量。此外，白抗乳酸菌代谢发生的干酪工方抗真菌物资可能缩短产物货架期，发生的胞外多糖可能改善面团的品质。鉴于此，乳酸菌发酵作为一种颇有远景的发酵方式，值患上进一步的探究。乳酸菌种类繁多，当初对于其飞腾小麦卵白抗原性的钻研多会集于植物乳杆菌发酵方面。干酪乳杆菌被证实具备细胞被膜卵白酶，而这种酶在降解卵白质的历程中起到很紧张的熏染。此外，大批钻研表明加工方式影响食物卵白的抗原性，当初用于飞腾食物卵白抗原性的加工措施主要有热加工(蒸煮、烘烤等)以及非热加工(发酵、酶解、超声等)。蒸煮等热加工方式会修正食物卵白的构象妄想，从而修正抗原的构象表位。而抗原卵白线性表位的破损主要爆发在发酵以及酶解历程中。Rao等钻研发现高温烘烤以及水煮可能发生较低致敏性的花生。Rui等运用植物乳杆菌发酵飞腾了大豆分说卵白的抗原性。运用碱性卵白酶以及木瓜卵白酶不断酶解飞腾了小麦中致敏谷卵白含量。本钻研运用分说自老面中的1株干酪乳杆菌发酵面团，钻研其对于小麦致敏卵白含量及抗原性的影响，钻研加工条件与抗原性之间的关连，为开拓低致敏性小麦废品提供实际凭证。

1 质料与措施

1.1 质料与试剂

革兰氏染色试剂盒、细菌组DNA提取试剂盒、乳酸杆菌抉择性琼脂、Bradfbrd卵白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE分说/稀释胶缓冲液、预染卵白Maker、SDS-PAGE卵白上样缓冲液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒。北京索莱宝科技有限公司：EL-TMB显色试剂盒，上海生工生物：试验所用试剂均为合成纯级，兔过敏血清由试验室重价。

1.2 主要仪器

PCR热循环仪，杭州晶格迷信仪器有限公司；凝胶成像零星，上海勤翔迷信仪器有限公司；Mul-tiskanFC酶标仪，上海赛默飞公司；mini-proteanⅡ凝胶仪，美国伯乐公司。

1.3 试验措施

1.3.1 干酪乳杆菌的分说判断

称取酸面团样品5g于无菌均质袋中，退出45mL灭菌后的卵白胨水(1％卵白胨，0.43％NaCl，0.72％Na₂HP0₄，0.36％KH₂PH0₄，pH7.0)，混匀后梯度稀释，取10^-5～10^-7稀释梯度，涂布于乳酸杆菌抉择性琼脂哺育基，37℃哺育24h。随机挑取菌落妨碍过氧化氢酶以及革兰氏染色试验。取过氧化氢酶阴性、革兰氏阴性且镜检为杆状的菌株妨碍进一步份子判断。

接管细菌组DNA提取试剂盒提取所分说菌株的DNA，运用细菌通用引物27F(5’-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTrGTACGA-3’)以及1492R(5’-GCAGAGTTCTCGGAGT.CACGAAGAGTlTI’GATCCTGGCTCAG-3’)经由PCR反映对于16SrRNA基因妨碍扩增。PCR反映条件为：94℃预变性5min：94℃变性30s。55℃退火30s，72℃缩短5min，35个循环：72℃短缺缩短10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送于北京生工生物工程有限公司测序。所患上序列与NCBI文库比对于后，用MegaX构建进化树。

1.3.2 菌株妨碍曲线以及菌落数与0D值对于应关连的测定

取一支冻存菌种于MRS液体哺育基中，37℃下活化24h。取O.5mL活化菌液于6个分说装有30mLMRS肉汤的三角瓶中。37℃哺育0，4，8，12，16，20h，在波长600nm处丈量各时段菌液吸光度值，绘制妨碍曲线。

取活化菌液用MRS肉汤稀释2，2.5，3，4，5，6倍，测定0D600nm值，并梯度稀释，倾注于MRS琼脂中，37℃哺育48h后合计活菌数。

1.3.3 酸面团的制备

取指数生临时菌液，6000×g离心10min，心理盐水洗涤2次，双蒸水重悬浮至50mL，调节OD‰值为0.8。100g面粉与50mL菌悬液投入以及面机。以及面15min，面团内菌体数目约为108CFU/g。发酵温度30℃，相对于湿度80％。发酵24h，定时取样。

1.3.4 发酵历程中pH值、可滴定酸度(TTA)以及面团卵白含量的测

每一隔2h取样，于无菌均质袋中10倍稀释后混合平均，测定pH值并用0.1mol/LNa0H滴定至pH值为8.3，记实所破费Na0H的体积数即，TTA值。

将发酵面团样品冻干后磨粉于-20℃保存。卵白提取参照Prado等的措施。详细操作如下：向500mg面粉中退出10mL％s-HCl缓冲液(50妹妹01，L，pH8.8)，于4℃下搅拌1h，20000×g，4℃离心20min，群集上清液(清卵白以及球卵白)；积淀用5mL缓冲液洗涤3次，退出10mL75％乙醇，室温下搅拌1h，离心20min，群集上清液(醇溶卵白)；接管5mL75％乙醇洗涤积淀3次，退出10mL50妹妹ol/LTris-HCl(pH8.8，1％SDS，0.5％DTT)，4℃搅拌2h，离心20min，群集上清液(谷卵白)。接管考马斯亮蓝法测卵白质品质浓度。

1.3.5 SDS-PAGE电泳及免疫印迹合成

参照Rao等的措施，详细操作如下：制备12％的分说胶以及5％的稀释胶，样品溶液稀释为相同浓度后与5x上样缓冲液混并吞滚水加热5min，进样后妨碍垂直电泳(稀释胶电压80V，分说胶电压110V)，电泳停止后接管考马斯亮蓝R250染色，脱色后于凝胶成像零星摄影。

未染色的电泳胶转移至硝酸纤维素膜上(300mA冰浴下转膜90min)，丽春红染色确认转膜乐成。退出5％脱脂奶粉，摇床上刚强封锁2h；退出稀释的-抗(抗小麦卵白兔血清)，4℃下孵育住宿；TBST缓冲液(0.02mol/LTBS，0.05％Tween-20，pH7.6)洗膜后，退出稀释的AP-羊抗兔二抗，室温下孵育90min；洗膜后。运用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色。

1.3.6 差距发酵方式及热加工措施制作馒头

向100g面粉(乳酸菌菌落数108～109CFU/g)中退出50mL菌悬液以及0.35g安琪酵母调制面团后分说发酵。冷藏发酵条件为：4℃发酵3d后于37℃，80％相对于湿度发酵60min：一次发酵条件为：37℃，80％相对于湿度发酵60min；二次发酵条件为：中种面团(60g面粉，0.35g酵母，30mL菌悬液)于37℃发酵4h后退出40g面粉以及20mL水不断发酵1h。发酵好的3种面团用于烤制(180℃，20min)以及蒸制(滚水蒸制20min)。取样冻干，磨粉备用。

1.3.7 卵白含量及酶联免疫吸附试验测

总卵白提取参照Akagawa等的措施，详细操作如下：25mg面粉退出1mL卵白提取液[40妹妹ol/LTris，8mol/L尿素，4％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(cHAPs)，冰浴下超声提取30s，6次；4℃下16000×g离心20min，群集上清液，考马斯亮蓝法测卵白品质浓度。

接管酶联免疫吸附试验评估样品抗原性。运用50妹妹ol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释卵白至5μg/mL，按100μL孔退出酶标板，4℃静置住宿；用TBST洗板4次，按150μL/孔退出1％BSA封锁液，37℃温育2h；TBST洗板后按100μL/孔退出运用1％BSA稀释的抗小麦卵白兔血清稀释液(1:10000)，37℃温育2h，洗板；按100μL/孔退出500倍稀释的羊抗兔HRP-IgG，37℃温育1h，洗板；运用TMB显色试剂盒显色，于波长450nm处测0D值。