朝鲜蓟茎叶中脂溶性提取物对于神经细胞的呵护熏染（一）

朝鲜蓟为菊科菜蓟属多年生木本植物，朝鲜主要种植于地中海地域，蓟茎源头于家养多年生的叶中家养型刺菜蓟，是脂溶一种富含营养物资的保健蔬菜，被以为是性提细胞一种功能性食物，具备缓解肝胆疾病及消化不良、取物抗氧化、对于抗菌、神经抗癌等多种心理功能活性。护熏朝鲜蓟的朝鲜可食部份为外部苞片及花托，不可食用的蓟茎工业副产物部份搜罗其外部苞片及茎叶，占全部植株鲜重的叶中80％摆布，组成大批的脂溶土地占用、资源浪费及情景传染，性提细胞因此对于朝鲜蓟茎叶副产物的取物开拓运用尤为紧张。

萜类化合物是异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，而倍半萜化合物及三萜化合物是朝鲜蓟中主要的亲脂类化合物。Ramos等从刺菜蓟中提取了脂溶性成份并对于其组分妨碍零星合成，其中去酰基菜蓟苦素、羽扇豆醇醋酸酯、ψ-蒲公英甾醇醋酸酯在种植型刺菜蓟中均为第1次报道。有文献表明，萜类化合物具备抗高血脂圈、抗炎嘲、抗癌划生平理活性，可是妨碍当初，对于朝鲜蓟副产物中萜类化合物的开拓运用及相关活性的钻研较少，对于其神经呵护熏染的报道更是缺少。
大批钻研表明，氧化应激诱惑的神经细胞伤害与多种神经退行性疾病无关，如阿尔兹海默症以及帕金森病等。在神经退行性疾病中，活性氧引起的氧化应激被普遍以为是神经细胞伤害的主要原因之一。现普遍以为，对于中枢神经零星进化的实用治疗措施是呵护神经细胞免受氧化伤害。有大批钻研证实，良多做作抗氧化物都具备神经呵护熏染。

本钻研接管GC-MS合成朝鲜蓟副产物脂溶性提取物中萜类及甾醇类化合物的组成与含量，经由测定差距目的钻研脂溶性提取物对于神经细胞的呵护熏染，为朝鲜蓟副产物的开拓运用提供参考。

1 质料与措施

1.1 质料与试剂

朝鲜蓟的茎叶等副产物于2018年4月份采自于中国云南省曲靖市陆良县中枢镇华侨农场，采收后当天赶快空运送往试验室，液氮冷冻干燥、破碎捣毁，过50目筛，装于自封袋中，于-20℃冰箱中保存。

正构烷烃(C7～C40)，上海安普试验科技股份有限公司；正十六烷(纯度>99.5％)、吡啶(纯度>99.9％)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；菜蓟苦素(纯度96.4％)、豆甾醇(纯度98％)、β-谷甾醇(纯度95％)、羽扇豆醇(纯度98％)，天津阿尔塔科技有限公司；α-香树脂醇(纯度≥98％)、β-香树脂醇(纯度≥98％)、AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒，美国Sigma-A1drich公司；三甲基氯硅烷(纯度>99％)、N，0-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(纯度96％)、二氯甲烷(合成纯级)，上海麦克林生化科技有限公司；30％H202溶液，国药总体化学有限公司；RPMll640哺育基、青霉素-链霉素、0.25％胰卵白酶，美国GIBCO公司；胎牛血清，美国HYCLONE公司；二甲基亚砜(DMSO)、PBS缓冲液、DPBS缓冲液、CCK8试剂盒、DCFH-DA试剂盒、吖啶橙-溴化乙锭(A0-EB)试剂盒，索莱宝生物科技有限公司；脂质氧化(MDA)试剂盒、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与配置装备部署

6890N/5973气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技公司：BDFACSEALIBUR型流式细胞仪，美国BD公司：YG-XD30型荧赫然微镜，中国PVD公司；Tis型颠倒相差显微镜，日本Nikon公司：InfiniteF50型酶标仪。澳大利亚TECAN公司。

1.3 脂溶性物资的提取

参考Romas等的措施并稍作更正。精确称取朝鲜蓟副产物冻干粉5g，退出125mL二氯甲烷，索氏提取7h。运用旋转蒸发仪在50℃下对于提取液妨碍低压干燥，旋蒸后退出二氯甲烷对于干燥后的提取物妨碍复溶，定容至25mL，取1mL氮吹至残缺干燥，于-20℃冰箱中保存。

1.4 GC-MS合成

参考Romas等的措施并稍作更正。在妨碍GC-MS检测以前，先妨碍三甲基硅烷化(TMS)衍生，向氮吹干燥后的脂溶性提取物中退出250μL含1mg正十六烷(内标)的吡啶，待提取物残缺消融后，退出250μL的N，O-双(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺以及50μL的三甲基氯硅烷，混合物于70℃反映30min。

气相色谱-质谱联用仪配以DB-5J&W毛细管柱(30m×0.25妹妹×0.25μm，美国安捷伦科技公司)，载气为高纯氦气(41cm/s)。色谱的操作条件为：自动进样，进样量1μL，进样口温度270℃，分流比30:1。柱温箱的升温挨次为：初始温度120℃，坚持2min，以4℃/min的速率升至250℃，而后以2℃/min的速率升至285℃，并坚持15min。质谱的操作条件为：离子碰撞方式，离子能量70eV，以全扫描方式妨碍信息收集。扫描规模为，以30～600，离子源温度230℃。
GC-MS色谱图的处置软件接管MSDChem-Station使命站(Agilent，VersionE02)。定性时，经由将色谱峰的质谱信息与相关文献及使命站所立室的NIST质谱库妨碍比力，需要时经由标样定性。定量时，主要的萜类及甾醇类化合物经由标曲定量。其余化合物经由内标(正十六烷)定量，服从均折算为样品中物资的含量，用mg/kgDM展现。

1.5 细胞哺育

参考Tang等的措施并稍作更正。将PCI2细胞用残缺哺育基(RPMI1640哺育基，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)接种于6孔板中，接种密度3×105个/mL。接种量2mL/孔，置于37℃，5％CO2的水套式CO2孵育箱中哺育24h。

1.6 细胞去世气愿望的测定

将PCI2细胞用残缺哺育基接种于96孔板中，接种密度3×105个/mL，接种量100μL/孔，于37℃，5％C02的孵育箱中哺育24h。用不残缺哺育基(RPMI1640哺育基，2％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)将脂溶性提取物稀释至高、中、低3个差距的品质浓度，分说处置PC12细胞8h后。退出含90μmol/LH202的不残缺哺育基哺育4h。与预呵护后伤害组相对于应，以未经脂溶性提取物呵护、经H202伤害的PCI2细胞作为模子组，以未经H2O2伤害、经高浓度脂溶性提取物处置的PCI2细胞作为脂溶性提取物呵护组。以未经任何处置的PC12细胞作为空缺比力组，运用CCK8法检测每一孔中细胞的存活率，参考Ding等圈的措施，将处置后的细胞移除了哺育基，退出100μL/孔配好的CCK8使命液，置于5％CO2的孵育箱中，37℃孵育2h。酶标仪检测橘黄色甲臌的破费量。检测波长450nm处的吸光度值，每一组做6个平行。

1.7 乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测

细胞哺育基中的LDH含量是掂量细胞伤害水平的紧张目的，对于凭证1.5节措施哺育好的细胞妨碍4组差距处置后，群集每一孔中的哺育基，凭证试剂盒剖析书检测哺育基中LDH活性。

1.8 抗氧化活性的测定

氧化应激会直接或者直接导致ROS介导的核酸、卵白质以及脂质伤害，而且波及癌变圜、神经退行性病变幽、动脉粥样硬化、糖尿病圆以及朽迈陶等。在神经退行性疾病中，活性氧(ROS)引起的氧化应激被普遍以为是神经细胞伤害的主要原因之一，本钻研运用2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针检测细胞内ROS水平。对于凭证1.5节措施哺育好的细胞妨碍脂溶性提取物处置组、模子组、空缺比力组3组处置后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰卵白酶消化细胞，于4℃，1500r/min离心3min后运用残缺哺育基洗涤细胞，凭证1:1000比例用无血清哺育基(RPMll640哺育基，1％青霉素-链霉素)稀释DCFH-DA。取0.5mL稀释液退出细胞，于CO2孵育箱中避光孵育20min，运用无血清哺育基洗涤细胞3次，用荧赫然微镜审核细胞荧光情景，并用流式细胞仪量化检测。检测条件为激发波长488nm。发射波长605nm。对于凭证1.5节措施哺育好的细胞妨碍4组处置后，凭证试剂盒剖析书对于细胞内丙二醛(MDA)水平妨碍检测，来判断脂质氧化的水平。

1.9 细胞凋亡的测定

对于凭证1.5节措施哺育好的细胞妨碍预呵护后伤害组、模子组、空缺比力组3组处置后，用不含EDTA的胰卵白酶消化群集细胞。杜氏磷酸缓冲液(DPBS)洗涤细胞2次，退出500μL去离子水稀释好的散漫缓冲液(1×)重悬细胞，上机前退出5μL膜联卵白V-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)以及10μL碘化丙啶(PI)，室温避光反映10min，细胞流式仪量化检测，检测条件为激发波长488nm，发射波长530nm。对于凭证1.5节措施哺育好的细胞妨碍预呵护后伤害组、模子组、空缺比力组3组处置后，向每一个细胞处置组的哺育基中退出40μLA0-EB染液，室温部署5min，荧赫然微镜摄影审核。

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